Компания Lamborghini планировала выпустить вторую, "компактную" модель ещё с 1988 г., но этому мешали финансовые трудности и постоянная смена владельцев. Перспектива стала реальной только после вхождения марки в состав Audi AG, в результате которого конструкторы из Санта-Агаты получили не только финансирование, но и доступ к передовым немецким технологиям. К началу XXI века в автомобилях Audi уже широко применялась алюминиевая пространственная рама, и её использование в сочетании с алюминиевым кузовом и независимой подвеской на двойных поперечных рычагах было идеальным для суперкара. Кроме того, для Lamborghini на базе мотора Audi V8 разработали новый силовой агрегат - 5-литровый 40-клапанный V10 90° с многоточечным впрыском топлива и системой смазки с сухим картером, мощностью 500 л.с. Его алюминиевый блок был установлен продольно перед задней осью вместе с 6-ступенчатой механической коробкой передач. В качестве альтернативы предлагалась 6-ступенчатая роботизированная трансмиссия E-Gear с электрогидравлическим управлением, работавшая как в автоматическом, так и в ручном секвентальном режиме с подрулевым переключателем.

Lamborghini Gallardo, названная в честь породы боевых быков, дебютировала на Женевском автосалоне 2003 г. Её дизайн был создан студией ItalDesign на основе прототипа Lamborghini Cala 1995 г. и доработан Люком Донкервольке из Lamborghini Centro Stile. Автомобиль имел длинную колёсную базу (2560 мм) и короткие свесы; спереди он напоминал Murcielago, за исключением длинных фар-лезвий. Двери Gallardo открывались обычным способом. Суперкар оснащался постоянным полным приводом, адаптивной подвеской с амортизаторами Koni FSD, вентилируемыми дисковыми тормозами с ABS и ESP, климат-контролем и стереосистемой. Первая серия Gallardo прошла модернизацию в 2005 г., когда была усовершенствована выхлопная система и добавлены 20 л.с. мощности. Версия родстер с электрогидравлическим приводом мягкой крыши появилась в 2006 г.

До 2007 г. Lamborghini Gallardo предлагалась только в базовом исполнении, пока на Женевском автосалоне не была представлена облегчённая модификация Gallardo Superleggera с панелями кузова из углеродного волокна и двигателем мощностью 530 л.с. Вместе с ней была показана и замена стандартной модели - Lamborghini Gallardo LP560-4, которая получила незначительный рестайлинг, более экономичный и экологичный двигатель V10 с прямым впрыском объёмом 5204 см3 и мощностью 560 л.с. и пересмотренную коробку передач E-Gear с гоночным режимом. Топовая модификация второго поколения LP570-4 Superleggera с 570-сильным мотором была разработана в 2010 г. и поступила в продажу вместе с родстером LP570-4 Spyder Performante. В том же году появилась и самая дешёвая модификация начального уровня - заднеприводная Lamborghini Gallardo LP550-2 с 5.2-литровым двигателем мощностью 550 л.с.

Lamborghini Gallardo стала самой популярной моделью компании: в общей сложности за 10 лет было построено 14022 экземпляра. Кроме стандартных модификаций, в это число входили многочисленные специальные издания: SE (2005), Nera (2006), LP550-2 Valentino Balboni (2010), Bicolore (2010), Tricolore (2011), LP 550-2 Super Trofeo (2010), Edizione Tecnica (2012), LP560-2 50° Anniversario (2013) и эксклюзивные версии для отдельных рынков. Lamborghini также поставляла Gallardo для полиции Италии и Лондона. Существовали и гоночные модификации Gallardo, разработанные совместно с Reiter Engineering для участия в чемпионатах FIA GT3, SUPER GT, Speed World Challenge GT и собственной серии Blancpain Super Trofeo. Одна из них, LP570-4 Super Trofeo, в 2011 и 2013 гг. была доступна в ограниченных количествах как серийный гоночный автомобиль. В 2013 г. она была приспособлена для езды по дорогам общего пользования и выпущена в 50-ти экземплярах как Lamborghini Gallardo LP570-4 Squadra Corse. Модификация имела съёмный капот из углепластика, углерод-керамические тормоза, заднее антикрыло, передний сплиттер, задний диффузор, 19-дюймовые глянцевые кованые диски и гоночную отделку интерьера.