В 1966 г. на смену первой модели 350 GT пришла Lamborghini 400 GT, оснащённая увеличенным до 3929 см3 двигателем V12 мощностью 320 л.с., а также 5-ступенчатой механической коробкой передач собственного производства. Кузов, как и раньше, изготавливала Carrozzeria Touring. Внешне 400 GT отличалась от 350 GT более плавной линией крыши с задним стеклом меньшего размера и сдвоенными круглыми фарами вместо одинарных овальных. Первая серия 1965-1966 гг., известная как 400 GT Interim, была двухместной, а вторая, представленная на Женевском автосалоне 1966 г., уже имела компоновку 2+2, при той же длине колёсной базы (2550 мм). Всего было продано 23 двухместных 400 GT и 224 четырёхместных.

На базе Lamborghini 400 GT было создано два эксклюзивных автомобиля: 400 GT Monza и 400 GT Flying Star II. Первый из них, купе в гоночном стиле, построило ателье Neri & Bonacini по заказу американского клиента, который хотел выступить на нём в 24 часах Ле-Мана. Так как 400 GT Monza не прошла омологацию, заказ был отменён, но после дебюта на автосалоне в Барселоне в 1967 г. машину удалось продать. Второй концепт-кар, показанный на Туринском автосалоне 1966 г., стал последним проектом миланской кузовной фирмы Touring до её возрождения в 2008 г. Lamborghini Flying Star II представляла собой трёхдверный универсал типа Shooting Brake с угловатым кузовом, покатой крышей и очень низкой третьей дверью.